１．６．１　原理

熒光原位雜交技術是根據糞大腸菌群特異的ＤＮＡ序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與待測水樣中ＤＮＡ分子雜交，經熒光檢測體系在鏡下對待測ＤＮＡ進行定性、定量分析。

１．６．２　檢測方法

（１）選擇專門針對糞大腸菌群的熒光標記探針序列，利用寡核苷酸探針與靶細胞專一性結合進行生物分析。基本實驗步驟為細胞固定、雜交、洗脫。

（２）雜交細胞通常用熒光顯微鏡檢測，利用流式細胞儀對每一個靶細胞的探針雜交物的熒光強度進行定量測定，然后確定菌群數。

２　各種檢測方法的比較

多管發酵法和濾膜法是糞大腸菌群標準檢測方法，這２種方法檢測時間相對較長（４８～７２ｈ），需確認試驗，試驗步驟較為繁瑣，干擾因素多，不適于大量樣品的分析，也不能對水的衛生學狀況做出快速評價。但標準方法具有費用較低、原理簡單、利于推廣的優點，此仍是常規監測中的主要檢測方法。紙片法和酶底物法，只需１８～２４ｈ培養即可報告結果，操作簡便，結果可靠，不需要確認試驗，酶底物法還可同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況。紙片法是中國環境監測總站推薦的試用方法，酶底物法已經被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構認可，能夠較**地判斷水樣的微生物污染狀況，適宜污染事故應急監測。ＰＣＲ技術用于大腸菌群的檢測仍然處于研究階段，還有許多技術上的限制需要突破，技術復雜，檢測費用較高，假陰性和假陽性的比例較高，缺乏精度，還有待于進一步改進，目前還不能廣泛用于糞大腸菌群的日常檢測。ＦＩＳＨ 技術是細胞水平上的一

種高度專一性檢測方法。它可以在８ｈ內給出定量檢測結果，有極低的假陽性和假陰性的比例。但其操作步驟較煩瑣，技術復雜，目前僅可以對水樣中低濃度菌群進行計數，不利于大規模推廣，因此ＦＩＳＨ技術沒有廣泛用于糞大腸菌群的常規監測。

３　各種檢測方法的應用

多管發酵法和濾膜法是糞大腸菌群標準檢測方法，是常規監測中的主要檢測方法，本文主要介紹其它幾種方法的應用。

３．１　紙片法

紙片法是中國環境監測總站推薦的試用方法，適宜污染事故應急監測，在食品行業和食具**效果中廣泛應用。頓玉慧［２］使用３ＭＰｅｔｒｉｆｉｌｍ腸桿菌科檢測紙片計數溫州七里港口水域中的腸桿菌科，并同ＳＮ 方法進行檢測比對，結果證明使用３ＭＰｅｔｒｉｆｉｌｍ 檢測片來檢測水域中的腸桿菌科是可行的，２種方法檢測的結果差異不顯著。趙凌宇［３］采集蘇州具有代表性的地表水水體２２個點位的樣品，進行糞大腸菌群的測定方法比較，認為紙片法適于測定受糞便污染程度較輕的湖泊水體。但是，該方法的培養時間對

陽性管率有明顯影響，認為１６～１８ｈ是比較理想的培養時間。趙春霞［４］用多管發酵法與快速紙片法進行標準菌株和環境水樣的對比，認為紙片法操作和結果判斷均較容易，精密度判斷值Ｒ＝０．２１９?。?，在受控范圍內，與多管發酵法的相關性也很好（ｒ＝

０．９３）。林彩華［５］將３Ｍ Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ 法應用于出口水產品的檢測，認為３ＭＰｅｔｒｉｆｉｌｍ法檢測大腸菌群的靈敏度不夠，無法檢測每克樣品含菌量１０個以下。孔梅［６］利用紙片法對食具**效果進行檢測，對出現可疑結果的紙片放入乳糖膽鹽培養液中再按常規發酵法的程序進行大腸菌群檢測，可提高紙片法的靈敏度，增加與常規發酵法的陽性符合率。２００８年綠洲生化致病菌測試片系列產品在北京奧運會食品**保障和抗震救災中，成為衛生部指定采購產品；２００９年病原微生物測試片項目被列入科技部科技型中小企業技術**基金項目；２０１０年上海世博會和廣州亞運會中，微生物快速檢驗產品進一步得到成功應用。

３．２　酶底物法

酶底物法已經被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構認可，能夠較**地判斷水樣的微生物污染狀況，廣泛用于糞大腸菌群的日常檢測。孫宗科［７］應用加標試驗和實際水樣檢測的方式比較酶底物法與多管發酵法用于水中大腸菌群的檢測方法的優劣和結果的一致性，得出檢測結果具有一致性（Ｐ＝０１０?。担梗訇栃月薀o統計學意義的差別（Ｐ

＝１．０００），可以用作評價水質微生物污染的標準方法。趙春霞［４］用標準菌株和環境水樣進行對比，酶底物法精密度判斷值Ｒ＝０．１３２　４，在受控范圍內，與多管發酵法也具有良好的相關性（ｒ＝０．８９）。鄭晶［８］用酶底物法檢測蔬菜中大腸菌群，與ＳＮ方法測試結果較為接近，無明顯的差異。孫錫娟［９］用酶底物快速檢測法檢測糞源性污染的蔬菜樣品，結果表明該法敏感性及準確性與多管發酵法相一致。２００８年科立得協助北京自來水公司、北京環境監測站、中國**預防控制中心、北京**預防控制中心、天津**預防控制中心等完成奧運**供水工作；美國愛德士（ＩＤＥＸＸ）公司科立得試劑在地震災區等條件惡劣地區仍能**準確檢測居民用水。

３．３　其它方法

Ｂｅｊ等［１０］將多重ＰＣＲ用于檢測與總大腸菌群相關的基因序列，這些序列與腸道病原菌包括（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｉｉａ?。螅穑穑停樱瑁椋纾澹欤欤帷。幔穑穑┯嘘P。Ｊｕｃｋ等［１１］利用嵌套式ＰＣＲ方法，并改進了Ｂｅｊ等提出的過濾方法，快速檢測水樣中低濃度的Ｅ．ｃｏｌｉ。明鎮寰［１２］對聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）快速檢測水體指示菌———大腸菌群和大腸桿菌進行了研究。采用的２對引物分別擴增了Ｌａｃ?。诨虻募s２６０ｂｐ和Ｕｄｉ?。粱虻募s１５０ｂｐ?。模危疗巍Ｒ铫窈鸵铫?低能分別擴增１０－６μｇ或１０－８μｇ基因組ＤＮＡ。整個檢測工作在采集水樣后５～６ｈ內完成。與常規水質檢測法相比，ＰＣＲ法具有快速、準確的特點，是有效監測環境水體指示菌的一種潛在的新方法。Ｒｅｇｎａｕｌｔ等［１３］利用Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕ探針檢測了尿、水（河水和生活污水）以及食品中的Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ。該探針對所研究的不同環境介質中的Ｅ．ｃｏｌｉ具有很好的專一性，已經成功地應用于飲用水樣品中Ｅ．ｃｏｌｉ的檢測。ＦＩＳＨ 方法的優點是不可培養的大腸菌群也可以被檢測出，其缺點是死細胞也可能被計數。因此，利用ＦＩＳＨ 方法對細菌計數后，尚需對細菌的生理狀態進行進一步研究。黃小平［１４］應用顯色熒光方法檢測牛奶或水中大腸菌群和大腸桿菌，該方法不需驗證步驟，研究過程中沒有發現假陽性和假陰性現象出現，靈敏度可達到１～５／１００ｍＬ。涂楚國［１５］ 研究出Ｌａｃｔｏｓｅ－__<___o___Ｔｒｙｐｔｏｎｅ－ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ－Ｔｒａｃｅ?。牛欤澹恚澹睿簦螅ǎ蹋裕樱牛┡囵B基，采用幾種鑒定驗證試驗的ＬＴＳＥ法，用來快速檢測水質、食品、冷飲、餐具等各類樣品７０３件，結果與國標法（ＧＢ）對照總符合率為９９．３％；同時與美國《水和廢水標準檢驗法》（１６版１９８５年）中檢測糞大腸菌群的正式Ａ－１法相比較特異性強，靈敏度高，能提高檢出率，并節約經費。張江龍［１６］利用法國ＣＯＬＩＬＥＲＴＲ３０００大腸桿菌在線自動監測儀，檢測到１個或更多大腸桿菌／１００ｍＬ水的時間不足１８ｈ，對于大腸桿菌污染較嚴重的水體來說，數小時之內就能檢測出來，較傳統的實驗室方法，大大縮短了測量時間，而且可以對水體中微生物的性質進行長期不間斷的采樣分析；由于ＣＯＬＩＬＥＲＴＲ試劑對大腸桿菌有非常高的選擇性（這點已被世界上許多國家的研究機構所證實和認可，并通過了美國ＵＳＥＰＡ 證實且被收錄到美國標準分析方法），該儀器的分析結果可信度極高。另外一種相對較快的大腸桿菌檢測設備是**醫學科學院研制的水質細菌檢驗箱，其基本原理是使用濾漠－營養墊法，所用的培養基是新研制的改良遠藤培養基，比普通的遠藤培養基能獲得更加滿意的檢驗結果，尤其是對水中損傷大腸菌的檢驗有較好的效果，６～１５ｈ后可得到糞大腸菌群數的監測結果；價格也不貴。適用于各級衛生防疫部門，水廠及飲水衛生檢驗單位、野外工作單位等在實驗室或野外條件下進行水中細菌總數和大腸菌群的檢驗。

４　結　語

目前，大腸菌群檢測方法發展很快，已提高到分子生物學水平，使檢測更快速、準確。新檢測技術的應用普及，不僅與操作技術的簡易程度和**度有關，也與檢測設備和試劑的費用高低、對環境的影響等有關。因此要實現實際操作應用與普及還需要經歷一個長期的反復驗證完善過程，需要不斷改進操作細節，使新技術的**度得到認可。紙片法和酶底物法以其操作簡便、檢測周期短，將取代多管發酵法、濾膜法等傳統方法，尤其是酶底物法采用密封培養技術，在檢測醫院污水時可以減少人員接觸而降低檢測人員的致病風險，因此具有更強的實用價值和應用價值，極有可能在近期成為評價水質微生物污染的快速標準檢測方法之一。自動化檢測方法亦將是監測工作的發展方向，在新技術支持下，**、快速、可靠、環保、低廉的自動檢測儀器也將會被研發并得到應用與普及。